近日，四川大学华西第二医院郭帆课题组在学术期刊Cell Research（IF：15.4）上在线发表了题为“IntegrativeSingle-cell Analysis of Transcriptome, DNA Methylome and ChromatinAccessibility in Mouse Oocytes”的最新研究成果。四川大学华西第二医院古婵博士为该论文的第一作者，实验助理吴啟洪为参与作者，郭帆研究员为通讯作者。
哺乳动物的成熟卵细胞具有对精子和体细胞核进行重编程的能力，从而产生新的子代或克隆个体。在哺乳动物卵细胞成熟过程中，其自身表观遗传修饰（如DNA甲基化修饰）和染色质状态也会发生剧烈改变；然而，该过程中的染色质重塑特征以及DNA甲基化和染色质状态之间的相互关系并不十分清楚。研究人员利用最新改进的单细胞多组学iscCOOL-seq（improved single-cellCOOL-seq）测序技术结合单细胞转录组测序技术、生物信息学分析、卵泡体外培养体系等，对小鼠总共1394颗卵细胞和卵泡进行了分析；在单细胞和单碱基分辨率上绘制了小鼠卵细胞成熟过程中的转录组图谱、DNA甲基化图谱和染色质状态图谱，并进行了各组学层面上的异质性分析和多种组学之间的关联分析；同时，结合卵泡体外培养体系对小鼠卵细胞成熟过程中的关键分子信号通路进行了验证。
研究人员首先发明了新的单细胞DNA甲基化文库构建方法——TAILS，并利用该方法对已有的single-cell COOL-seq技术进行了系统性的改进，使得新改进的iscCOOL-seq多组学测序技术在保留高准确度和高精度的同时，显著提高了测序读段的比对率。随后，研究人员对小鼠卵细胞发育多个代表性阶段共1030颗卵细胞进行了多组学联合分析，并作出了如下新发现：
（1）在卵细胞生长成熟的过程中，单个卵细胞在开启生长的前后阶段会经历染色质状态的剧烈改变，同时转录组也会相应发生显著变化；而基因组整体DNA甲基化水平在卵细胞开启生长前后仍然低于5%，未有大幅度增加（下图）。提示处于非生长期的Non-growing Oocytes拥有非常独特的染色质状态和转录组特征、
（2）在卵细胞生长成熟的过程中，单个卵细胞之间的DNA甲基化异质性显著增强，尤其在基因组的重复元件和异染色质区域；染色质状态的异质性在开放染色质区域较高。
（3）在卵细胞生长成熟的过程中，开放染色质主要富集于基因的启动子、CpG岛和H3K4me3修饰区域，这些区域往往拥有低DNA甲基化水平；对于基因组中的Partially Methylated Domains（PMDs），其开放染色质富集程度远低于基因组其它区域。提示在卵细胞生长过程中，DNA甲基化水平与开放染色质富集程度紧密相关。
（4）在卵细胞生长成熟的过程中，转录起始位点（TSS）和终止位点（TES）附近都会显著富集开放染色质；而转录起始位点附近富集的开放染色质区域往往与基因的Alternative Promoters重合。提示卵细胞的基因启动子拥有独特的染色质状态特征。
（5）在卵细胞生长成熟的过程中，起始性DNA甲基化（De novo DNA methylation）往往发生在Gene Bodies区域。对于发生了起始性DNA甲基化的Gene Bodies区域，其对应基因的启动子区域早在Non-growing Oocytes阶段就成开放状态；对于没有发生起始性DNA甲基化的Gene Bodies区域，其对应基因的启动子区域则倾向处于关闭状态。提示卵细胞中，基因启动子的染色质状态、基因转录与起始性DNA甲基化之间存在着精密的调控关系。
（6）在卵细胞生长成熟的过程中，以组蛋白修饰相关因子为代表的部分表观因子会呈现阶段性的特异表达；以NOTCH信号通路下游转录因子Rbpj为代表的部分转录因子的结合位点会呈现阶段性的开放染色质富集。提示表观与转录调控在卵细胞成熟过程中起重要作用。
最后，研究人员结合卵泡体外培养体系，利用小分子抑制剂对基于单细胞多组学联合分析鉴定出来的关键分子信号通路——NOTCH信号通路在卵细胞成熟中的作用进行了验证。研究人员通过对总共364颗小鼠卵泡的体外记录培养，发现在培养体系中加入NOTCH信号通路的抑制剂后，小鼠卵泡的成熟会显著受到抑制，提示NOTCH信号通路在小鼠卵细胞成熟过程中起重要作用。
该研究系统地描绘了哺乳动物的卵细胞在发育成熟过程中，DNA甲基化、染色质状态和基因表达发生的精准、有序的变化，以及多种组学层面之间的相互关系；为今后人们继续研究哺乳动物卵细胞重编程能力的获得奠定了基础，同时为体细胞克隆效率的提高以及卵细胞发育异常的研究提供了新思路。
据悉，该工作得到四川大学华西第二医院转化医学中心主任张林教授、产前诊断中心主任刘珊玲教授和生殖医学科的大力支持,同时得到了国家科学技术部、国家自然科学基金委员会、四川省科技厅、中央高校基本科研基金和华西第二医院科研启动基金的资助。
通讯作者简介：
郭帆，四川大学研究员，博导，长江青年学者（2017），国家自然科学基金优秀青年基金获得者（2018）；主要研究方向为哺乳动物胚胎发育/生殖细胞发生过程中基因表达的表观遗传调控规律，以第一作者或通讯作者（含共同）在Cell（2015）、Nature（2011）、Cell Stem Cell（2014）、Nature CellBiology（2018）、Cell Research（2017，2018）和Nature Communications（2018）等学术期刊发表多篇研究论文。
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